Facebook             

Telegram           

بلاگ

27 تیر, 1398

فعالیت انتی اکسیدانتی و پتانسیل احیایی روغن آرگان خالص

خلاصه
روغن آرگان خالص (Argania spinosa L) از قرن¬ها پیش در کشور مراکش به عنوان روغن زینتی برای حفظ تعادل چهره و درمان اسکارهای پوستول ابله مرغان استفاده می شده است. در اینجا اثر تنظیمی روغن آرگان خالص بر ملانوژنز در سلولهای ملانومای مورینB16 ارزیابی می¬شود. ارزیابی نتایج ملانین با استفاده از سلولهای B16 تیمار شده با غلظت¬های مختلف روغن آرگان نشان دهنده¬ی کاهش وابسته به دوز در محتوای ملانین بود. نتایج وسترن بلات نشان دادکه سطوح بیان تیروزیناز (TYR)، پروتیین وابسته¬ به تیروزیناز-1(TRP1) و پروتیین دوپوکرام توتومراز(DCT) کاهش می¬یابد. علاوه بر این افزایش در فعال شدن MITF و ERK1/2 نیز مشاهده شد. نتایج Real-time PCR نشان دهنده¬ی تنظیم کاهشی در بیان mRNA ژن های TYR، Trp1،DCT و Mitf بود.درمان با روغن آرگان خالص باعث فسفریلاسیون MITF و در نتیجه مهار رونویسی آنزیم های ملانوژنیک –TYR و DCT میشود. اثر بازدارندگی روغن آرگان بر بیوسنتز ملانین می¬تواند به توکوفرول و اثرات سینرژیک آن مربوط باشد. نتایج این مطالعه پایه¬¬های علمی برای فواید سنتی روغن آرگان خالص را فراهم آورد و توانایی بالقوه¬ی آن برای درمان بیماری های هیپرپیگمانتاسیون را آشکار کرد.
1. مقدمه
استفاده از روغن آرگان خالص برای مرطوب کردن پوست و حفظ تعادل چهره در میان زنان مراکشی ثابت شده است. Argania spinosa (Skeel) یک گونه¬ی درختی بومی در مراکش بوده و دارای ارزش اقتصادی-اجتماعی فراوان در این ناحیه است. میوه¬ی A. spinosa دارای یک دانه¬ی روغن زاست که از آن روغن آرگان خالص بدست می¬آید که در طب بومی و لوازم آرایشی بویژه در مناطق جنوب غربی استفاده میشود. از قدیم ، روغن آرگان خالص آرایشی برای درمان انواعی از جوش های پوستی مانند جوش جوانی و اسکارهای پوستول¬های ابله¬مرغان استفاده می¬شد. همچنین گفته میشود که روغن آرگان خالص باعث کاهش مسائل خشکی پوست شده و ظهور چین چروک را کند می¬کند. روغن آرگان خالص همچنین برای درمان پسوریازیس، اگزما، دردهای مفصلی، التهاب پوست و جرب ، برای بهبود سوختگی و زخم ، برای بهبود شکنندگی ناخن و نیز جلوگیری از ریزش مو و خشکی مو استفاده میشود. روغن آرگان استفاده شده در لوازم آرایشی روغن استخراج شده با فشار سرما از دانه¬های میوه¬ی آرگان است که اکنون در جهان شناخته شده است. این روغن به عنوان گرانترین سبزیجات و روغن آرایشی شناخته میشود و منبع درآمد زنان مراکشی است که عضو تعاونی زنان هستند. در نواحی جنوبی مراکش تعاونی ها روغن آرگان را برای مصارف غذایی و آرایشی تولید می¬کنند. استخراج روغن آرگان برای مصارف خوراکی و ارایشی اکنون با روش های سنتی انجام می¬شود. روغن آرگان خالص غنی از توکوفرول¬ها ، اسیدهای چرب متوسط زنجیر ، کارتنوئیدها ،اسکوالن¬ها و اولئیک اسید است.
هیپرپیگمانتاسیون اکتسابی پس از قرار گیری طولانی مدت در معرض نور خورشید و یا ملاسما و ملانودرمای پس از التهاب با ویژگی تولید و تجمع ملانین شناخته میشوند. بیوسنتز ملانین در سلولهای رنگدانه با کمک آنزیم های تیروزیناز، پروتیین وابسته به تیروزیناز 1 و دوپاکروم توتومراز کاتالیز میشود. هیپرپیگمنتاسیون زمانی اتفاق می¬افتد که فعالیت این آنزیم ها توسط فاکتورهای تحریک کننده مانند نور فرابنفش و التهاب مزمن افزایش می¬یابد. روش های مختلفی برای بیان این مشکلات موضوع مورد پژوهش بسیاری از پژوهشگران است. عوامل دپیگمانتاسیون(سفید کردن پوست) در کشورهای غربی نه تنها برای مهار و درمان هیپرپیگمانتاسیون نامنظم استفاده میشود بلکه بر اساس باورهای سنتی آسیایی ازآن برای سفید تر کردن پوست نیز استفاده می¬شود.
استفاده از عوامل شیمیایی مانند هیدروکوئینون و کوجیک اسید (از میان بسیاری دیگر) پرطرفدارترین راه های مدیریت هیپرپیگمانتاسیون هستند. با این وجود عدم استفاده¬ی پیوسته از عوامل دپیگمتنتاسیون باعث ایجاد اثرات جانبی نامطلوبی مانند آلرژی، کرونوزیس اکزوژنز، درماتیتیس عفونی، و به ویژه درماتوفیتوزیس منتشر و سلولیت نکروتیک ، اگزمای تماسی و پیگمانتاسیون های خاص میشود. به دلیل همین اثرات جانبی نامطلوب است که امروزه استفاده از عوال دپیگمنتاسیون طبیعی و بومی به عنوان بهترین روش برای کنترل هیپرپیگمنتاسیون به نظر می¬رسد. اثر دپیگمنتاسیون اجزاء روغن آرگان خالص مانند اسیدهای چرب آزاد ، توکوفرول¬ها ،و کارتنوئیدها برای محافظت پوست از نور خورشید گزارش شده است. با این وجود تاکنون هیچ مطالعه¬ای بر روی اثر روغن آرگان خالص کامل بر روی بیوسنتز ملانین در کشت سلولهای مورین انجام نشده است. این مطالعه استفاده از روغن آرگان خالص به عنوان یک عامل دپیگممنتاسیون و مکانیسمی که این اثرات تحت تاثیر آن قرار دارد را ارائه می¬دهد.
2. مواد و روش
2.1. منشاء نمونه¬ی روغن آرگان و انالیز ترکیبات اجزاء سازنده.
روغن آرگان استفاده شده در آزمایش با لطف Alain-Claude Kerrien تهیه شده بود. این روغن یک روغن آرگان از نوع ارایشی آن بود که در تعاونی زنان (تعاونی agdal، منطقه ی Essaouira، مراکش) با روش پرس مکانیکی دانه¬های درخت آرگان به دست آمده بود.
اسید چرب و اجزاء ترکیبات آن بااستفاده از روش¬های استاندارد تعیین شد: روش NF EN ISO 5508 برای ترکیبات اسید چرب (متیل استر%) ، ISO 9936 برای ترکیبات توکوفرول و NF ISO 6799 برای ترکیب استرول.
2.2 فعالیت آنتی اکسیدانی روغن آرگان
2.2.1 ارزیابی سفیدکنندگی بتاکاروتن/لینولئیک اسید
ارزیابی سفیدکنندگی بتاکاروتن/لینولئیک اسید بر اساس روش Miraliakbari و Shahidi و با اندکی تغییر انجام شد. با حل کردن 0.5 میلی گرم از بتاکاروتن در 1 میلی لیتر از کلروفرم (در گرید hplc) و 25 میکرولیتر از لینولئیک اسید در 200 میلی گرم از tween20 ترکیبی از بتاکاروتن و لینولئیک اسید تهیه شد. کلروفرم تحت شرایط خلاء به طور کامل تبخیر شد و به دنبال آن 100 میلی لیتر آب مقطر به محلول باقیمانده اضافه شد سپس ترکیب حاصل با دور بالا شیک شد تا امولسیون حاصل شود. از این امولسیون 2و نیم میلی لیتر به لوله¬های آزمایشی مختلف حاوی 350 میکرولیتر از نمونه در استون با غلظت های مختلف انتقال داده شد. همه¬ی نمونه¬ها به مدت یک دقیقه ورتکس شدند و سپس به مدت 2 ساعت در حمام اب 50 درجه¬ی سانتی گراد به همراه یک کنترل منفی که حاوی حجم یکسانی از استون بدون نمونه بود، قرار داده شدند. جذب نمونه¬ها در مقابل بلانک (امولسیون بدون بتاکاروتن) در طول موج 470 نانومتر با استفاده از اسپکتروفوفتومتر انجام شد. از یک BHT استاندارد به عنوان کنترل استفاده شد.
فعالیت های انتی اکسیدانت (درصد مهارکنندگی) نمونه ها با استفاده از معادله ی زیر محاسبه شد:
= I% ( جذب بتاکاروتن دو ساعت بعد از جذب اولیه¬ی بتاکاروتن *100) *100
در این معادله ارزیابی بتاکاروتن بعد از دو ساعت نشان دهنده ی مقدار جذب بتاکاروتن بعد از دو ساعت قرار گیری در نمونه و جذب اولیه ی بتاکاروتن نشان دهنده¬ی مقدار جذب بتاکاروتن در نقطه¬ی شروع آزمایش است. همه¬ی آزمایش ها سه بار تکرار شدند و درصد مهار به صورت میانگین این سه تکرار گزارش شد.
2.2.2. فعالیت احیاء کنندگی روغن آرگان خالص
پتانسیل احیاء روغن آرگان خالص با استفاده از روش Bounatirou و همکارانش تعیین شد. غلظت های مختلفی از روغن آرگان در استون (1ml) با فسفات بافر (2.5ml، 0.2M و PH6.6.)و پتاسیم فری سیانید (2.5 ml ، 1%w/v) ترکیب شد. این ترکیب در دمای 50 درجه به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. تری کلرو استیک اسید (10%, 2.5ml) به ترکیب اضافه شده و به مدت 10 دقیقه در 1200g سانتریفیوژ شد. لایه¬ی بالایی محلول (2.5ml) با اب مقطر (2.5ml) ترکیب شد و FeCl3 (0.5ml , 0.1%) به ان اضافه شده و سپس با استفاده از یک اسپکتروفوتومتر جذب نمونه در طول موج 700 نانومتر اندازه¬گیری شد. غلظت عصاره ی فراهم کننده ی جذب 0.5 (IC50) با رسم نمودار جذب در 700 نانومتر در برابر غلظت مربوطه محاسبه شد. BHT و اسکوربیک اسید به عنوان ترکیبات مرجع استفاده شدند.
2.3 کشت سلول روغن آرگان خالص
سلولهای ملانومای مورین B16 (سلولهای B16) استفاده شده در آزمایش از بانک سلولی Riken در Tsukuba در ژاپن خریداری شده و به صورت یک کشت تک لایه در محیط تغییر یافته¬ی Dulbecco’s (محیطEagle’s ) غنی شده با 10% از سرم گاوی جنینی (igma, St. Louis, MO, USA) ، 4mm1-glutamine (sigma) ، 50mL/unit پنیسیلین، 50µg/ml استرپتومایسین (Cambrex, East Rutherford, NJ, USA) در دمای 37 درجه و در اتمسفر 5% از co2 نگه داری شد.
2.4 کمی سازی ملانین
محتوای ملانین سنتز شده با سلولهای ملانومای B16 تیمار شده با روغن آرگان خالص با روشی که قبلا گفته شد تعیین گردید. سلولهای B16 در پتری دیش های 100 میلی متری با چگالی 5*105 سلول در هر دیش کشت شده و در دمای 37 درجه و 5% دی اکسید کربن انکوبه شد. بعد از یک شبانه روز انکوباسیون محیط کشت با یک محیط تازه ی حاوی اربوتین (100µM) یا روغن ارگان با رقت های(1/100, 1/1000 , 10000V/V) جایگزین شد. بعداز 48 ساعت انکوباسیون محیط رشد دور ریخته شد و سپس سلولها دوبار در بافر فسفات سالین (BPS ) شسته شد و با تریپسینازیاسیون (0.25% trypsin/0.02% EDTA in PBS; Sigma) جمع آوری شد. سلول ها پلت شده و تریتون X-100 برای برای حل کردن غشاء سلول اضافه شد. سپس ملانین سنتز شده خالص شده و در تری کلرواستات 10% رسوب داده شد و ملانین در یک میلی لیتر سدیم هیدروکسید8 نرمال به مدت 2 ساعت و در دمای 28 درجه حل شد. جذب محلول ملانین در 410 نانومتر اندازه گیری شد و مقدار ملانین از روی نمودار استاندارد برای ملانین سنتتیک محاسبه شد. زنده بودن سلول و مقدار کل سلول با استفاده از برنامه¬ی ViaCount متعلق به Guava PCA (GE Healthcare, UK Ltd., Buckinghamshire, UK) ارزیابی شد. مقدار ملانین به صورت به صورت مقدار ملانین /سلول بیان شد(درصد کنترل).
2.5. وسترن بلات
نمونه¬های پروتیینی برای وسترن بلات از سولهای B16 کشت شده در پتری دیش های 100mm و با چگالی 3*106 سلول در هر دیش استخراج شد. بعدا از رشد شبانه¬ی سلول محیط رشد با محیط جدیدی حاوی هیرسینA (HA) ،یک بازدارنده¬ی ملانوژنز، یا روغن آرگان (1/10000, 1/1000, 1/100) جایگزین شده و برای 24 تا 48 ساعت دیگر انکوبه شدند. سپس محیط دور ریخته شد و قبل از استخراج کل پروتیین با بافر RIPA سلولها دوبار با بافر PBS شسته شدند. نمونه¬ی پروتیین (15µg) به وسیله¬ی الکترفورز ژلی در ژل SDS10% حل و به غشاء نیتروسلولزی منتقل شده و و با انتی بادی اولیه برای تیروزیناز و(MIFT) فاکتور رونویسی وابسته به میکوفتالامیا ، تیروزیناز (TYR) ، پروتیین وابسته به تیروزین -1 ، دوپاکروم توتومراز (DCT)، P-ERK1/2 ، ERK2 و GAPDH بلات شد. سیگنال با استفاده از سیستم تصویر برداری فروسرخ LiCor Odyssey بعد از واکنش با IRDYE 680LT بز علیه موش ، IRDYE 800CW الاغ علیه بز و IRDYE 800CW بز علیه خرگوش تجسم شد.
2.6 انالیز REAL-TIME PCR کمی
سلولهای B16 در پتری دیش های 100mm با چگالی 3*106 سلول در هر پتری دیش مطابق بالا کشت شدند. بعد از رشد شبانه¬ی سلول محیط رشد با یک محیط تازه با یا بدون روغن آرگان (1/100, 1/1000 , 1/100 ) جایگزین شده و برای 24 ساعت دیگر انکوبه شد. سپس محیط دور ریخته شده و سلولها قبل از استخراج mRNA کل با کیت ISOGEN دوبار با بافر PBS شسته شدند و با استفاده از اسپکتروفوتومتر )NanoDrop2000تکنولوژی NANO DROP) کمی سازی شدند. این RNA ها سپس به عنوان الگو برای واکنش زنجیره¬ای پلی مراز رونویسی معکوس (RT-PCR) با استفاده از کیت رونوشت بردار معکوس SuperScript III و بر اساس دستورالعمل تولید کننده استفاده شدند. برای کمی سازی بیان mRNA ژن تیروزیناز (Tyr) ، واکنش زنجیره¬ای پلیمراز REAL-TIME کمی با 7500 سیستم Real-Time PCR سریع با استفاده از ترکیب عمومی Taqman و پروب های taqman با پروتکل دمایی زیر انجام شد:95 درجه ی سانتی گراد برای 10 دقیقه و به دنبال آن 45 چرخه ی 95 درجه در 15 ثانیه و 60 درجه به مدت 1 دقیقه . از Gapdh به عنوان کنترل استفاده شد. پرایمرهای اختصاصی taqman برای tyr، trp1، DCT، Mitf و Gapdh از بیوسیستم کاربردی گرفته شد. داده ها با استفاده از نرم افزار 7500 سیستم sds سریع انالیز شدند
2.7 انالیزهای آماری
نتایج به صورت مقدار مطلق +- sds بیان شد و اختلافات بین نمونه های تیمار شده و تیمار نشده با استفاده از روش t-test ارزیابی شد. اختلافات 5% با اهمیت در نظر گرفته شد.
3 نتایج
3.1. انالیزهای شیمیایی روغن آرگان خالص
انالیزهای شیمیایی روغن آرگان خالص ارایشی استفاده شده در ازمایش انجام شد. جدول 1 مقدار بیشترین اسید های چرب در روغن آرگان خالص را نشان میدهد اولئیک اسید (46.1%) ، لینولئیک اسید(34.5%) ، پالمیتیک اسید (12.5%) و اسئاریک اسید (6.23%) . مقدار توکوفرول موجود در نمونه نیز ارزیابی شد و نتایج نشان داد که توکوقرول کل 63.5mg/100g روغن است و الفا توکوفرول ها بیشترین مقدار توکوفرول ها است(44mg/100g oil) جدول2. انالیزهای شیمیایی همچنین نشان دهنده¬ی حضور الکل های تری ترپن ، کارتنوئید¬ها و زانتوفیل¬هاست. استرول های موجود در روغن آرگان بتا –سیتوسترل (بالاترین غلظت) ، اسپینااسترول ، schottenol و بتا سیتواسترول است. سایر اجزاء شامل کارتنوئیدها (2 mg/kg) و زانتوفیل ها (1.7 mg/kg) هستند.
اسیدهای چرب اصلی موجود در روغن آرگان خالص استفاده شده در آزمایش.
توکوفرول های موجود در روغن آرگان خالص استفاده شده در آزمایش.

3.2. فعالیت انتی اکسیدانتی و پتانسیل احیایی روغن آرگان خالص
فعالیت آنتی اکسیدانتی روغن آرگان خالص با استفاده از مدل بتاکاروتن –لینولئات تعیین و با BHT مقایسه شد. نتایج نشان داد که روغن آرگان مانع از سفید شدن بتاکاروتن شد و بنابراین ممکن است در محافظت لیپوپراکسیداسیون سهیم باشد.(جدول 3). علاوه براین برای تعیین توانایی روغن آرگان خالص به عنوان یک دهنده¬ی الکترون (پتانسیل احیایی آن ) نیز ارزیابی شد. دهنده¬ی الکترون با رادیکال های آزاد واکنش میدهد، آنها را به محصولات پایدارتر تبدیل می¬کند و نهایتا به واکنش های زنجیره¬ای رادیکال پایان میدهد. ظرفیت احیایی یک ماده به عنوان یک نشانگر مهم برای فعالیت انتی اکسیدانتی بالقوه¬ی آن ماده در نظر گرفته میشود. روغن آرگان برخی از درجات ظرفیت الکترون دهندگی را نشان داد اما میزان آن پایین تر از انتی اکسیدانت سنتتیک BHT ((EC50 = 31.33 ± 0.03 μg/mL) و اسکوربیک اسید((EC50 = 6.89 ± 0.01 μg/mL) است.

جدول 3. فعالیت آنتی اکسیدانت روغن آرگان خالص و انتی اکسیدانت های سنتتیک (BHT و اسکوربیک اسید ) در ارزیابی سفید کنندگی بتاکاروتن و روش های احیایی.

3.3 تاثیر بر محتوای ملانین سلول¬های B16
مقدار ملانین درون سلولی در سلولهای B16 تیمار شده با روغن آرگان خالص کمی سازی شد. روغن آرگان خالص با محیط رشد ترکیب شده و پیش از تیمار سونیکه شد. سلولها با نسبت های حجمی 1/100،1/1000 و 1/10000 از روغن آرگان خالص تیمار شده 48 ساعت انکوبه گردید و سپس با استفاده از روش گفته شده در بخش مواد و روش محتوای ملانین کمی سازی شد. نتایج نشان داد که تیمار با روغن آرگان منجر به کاهش وابسته به دوز در محتوای ملانین سلولهای B16 میشود. نتایج ارزیابی حیات سلولی نشان داد که به جز در رقت 1/100 روغن آرگان خالص هیچ اثر سیتوتوکسیکی بر سلولهای B16 ندارد. انکوباسیون طولانی تر (72 ساعت ) یک کاهش چشمگیر وابسته به زمان در محتوای ملانین سلولها را نشان داد. (شکل 1). در مقایسه با آربوتین ، یک بازدارنده¬ی ملانوژنز شناخته شده، سلولهای تیمار شده با روغن آرگان خالص برای 72 ساعت مقدار ملانین یکسانی با سلولهای تیمار شده با آربوتین دارند. رنگ لیزات سلول حل شده در سدیم هیدروکسید به روشنی نشان دهنده¬ی اثر دپیگمنتاسیون روغن آرگان است. (شکل 1b).

شکل 1. اثر روغن آرگان در حجم های 1/10000 ، 1/1000 و 1/100 بر محتوای ملانین و زنده بودن سلول (گراف خطی) ملانومای B16 در دیش های 100mm در چگالی سلولی 5*105 .( b) لیزات سلولها.

3.4 بیان سلولهای ملانوژنیک در سلولهای B16
بیوسنتز ملانین به وسیله¬ی سه آنزیم کاتالیز میشود: تیروزیناز، پروتیین وابسته به تیروزیناز -1 و دوپاکروم توتومراز (DCT) .در اینجا بیان این سه آنزیم با انجام وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی تعیین شد و نتایج نشان داد که تیمار با نسبت حجمی 1/1000 روغن آرگان بیان تیروزیناز و پروتیین های Dct را با یک رفتار وابسته به زمان مهار میکند ، بیشترین مخهارکنندگی آن به 72 ساعت پس از تیمار مربوط میشود. شکل 2a . مانند تیروزیناز کاهش چشمگیری در بیان DCT نیز اتفاق افتاد که در موردTRP1 مشاده نشد. ارزیابی های چگالی سنجی بیان پروتیین ها نشان داد که در اینجا 60 درصد در بیان TYR و 80 درصد دربیان DCT کاهش اتفاق افتاده است. (شکل کاهش اتفاق افتاده است. (شکل2b). لازم بذکر است که کاهش چشمگیری در بیان TRP1 اتفاق نیافته و تنها 10 درصد کاهش بیان پس از 72 ساعت تیمار با روغن آرگان مشاهده شده است(در مقایسه با کنترل تیمار نشده). همانطور که نشان داده شد کنترل مثبت hirsein A به میزان قابل توجهی باعث کاهش بیان هر سه آنزیم شد.

شکل 2 . اثر روغن آرگان بر بیان تیروزیناز ، پروتیین وابسته به تیروزیناز 1 و دوپاگروم توتومراز با وسترن بلات تعیین شد (a) و مقادیر چگالی سنجی انها (b) .
3.5 مکانیسم مولکولی مربوط به اثر دپیگمنتاسیون
بیان ژنهای انزیم های ملانوژنیک با MITF تنظیم می¬شود که به عناصر تنطیمی ژنهای Tyr, Trp1, و Dct متصل میشود. بیان کل و فسفریله ¬شده¬ی ERK1/2 و MITF با استفاده از وسترن بلات ارزیابی شد و نتایج نشان از افزایش چشمگیر در فعال شدن ERK حدود 24 ساعت پس از تیمار با روغن آرگان داشت.(شکل 3a). در مقایسه با هیریسین A که بعداز یک ساعت فسقریلاسیون چشمگیر ERK را باعث میشود این اثر توسط روغن آرگان بعد از 24 ساعت اتفاق میافتد . افزایش در سطح بیان MITF (شکل 3a) و نسبت mitf فسفریله شده به mitf کل بعد از 48 ساعت تیمار با روغن آرگان مشاهده شد. شکل 3b).

شکل 3 . اثر وغن آرگان بر بیان کینازهای قسقریله ی خارج سلولی مرتبط با سیگنال (pERK1/2) ، ERK1 ، ERK2 ، فاکتور رونویسی وابسته به میکروافتالمیای فسفریله ((pMITF) و کل پروتیین های a )MITF) و مقادیر چگالی سنجی انها ….
برای تایید اثر افزایش فسفریلااسیون MITF بر کاهش بیان mRNA مربوط به , Tyr, Trp1و Dct، از روش Real-time pcr استفاده شد. نتایج نشان داد که روغن آرگان به میزان چشمگیری باعث تنظیم کاهشی بیان Tyr و Dct میشود ولی چنین اثری بر Trp1 ندارد.(شکل 4a). برای تعیین اثر روغن ارگان بر بیان MITF در سطح رونویسی ، بیان ژن های Mitf با استفاده از Real-time pcr کمی سازی شد. نتایج نشان از تنظیم کاهشی در بیان mRNA ژن Mitf داشت (4bشکل ) .

شکل 4. اثر روغن آرگان بر (a) بیانmRNA تیروزیناز ، پروتیین پرتبط با تیروزیناز و دوپاکروم و (b) فاکتور رونویسی مرتبط با میکروافتالمیا با استفاده از real-time PCR تکمن کمی سازی شد. سلولهای ملانومای b16 کشت شدند…..

4 بحث
فواید بهداشتی مصرف روغن آرگان به میزان زیادی گزارش شده است. اثر ضد سرطانی روغن آرگان و اثرات هیپرلیپیدمیک آن تایید شده است. در این مطالعه اثر روغن آرگان بر پوست با استفاده از رده ی سلولی ملانومای B16 در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی شد. روغن آرگان توسط زنان مراکشی به عنوان روغن آرایشی استفاده می شده است اما اخیرا توجهات زیادی به روغن آرگان در کشورهای آفریقای شمالی پیدا شده است. شیمیدانان اروپایی کشف کرده اند که روغن آرگان خواص بیوشیمی مطلوبی را از خود نشان میدهد که برای لوارم ارایشی تجاری در اروپا ، اسرائیل و سرتاسر جهان مفید است.
پیگمنتاسیون پوست به مقدار ملانین و پراکندگی آن در پوست بستگی ارد. در حین تولید ملانین سلولهای رنگدانه ای مانند سلولهای B16 به مقدار تیروزیناز در سلول و یا ترکیبات و فاکتورهای مهار کننده یا فعال کننده ی آنزیم بستگی دارد.اربوتین، کوجیک اسید و اسکوربیک اسید معدودی از شناخته شده ترین ترکیباتی هستند که میتوانند بیوسنتز ملانین را مهار کنند. اثر گذاری عوامل دپیگمنتاسیون بر روی ملانوژنز با کمی سازی محتوای ملانین در سلولهای رنگدانه ارزیابی شد. بیوسنتز ملانین در ملانوزوم هایی اتفاق میافتد که دارای آنزیم های تیروزیناز ، پروتیین وابسته به تیروزیناز -1 و دوپاکروم توتومراز است. اولین دو واکنش محدود کننده ی سرعت ملانوژنز به وسیله ی تیروزیناز کاتالیز میشود و این واکنش ها عبارتند از هیدروکسیلاسیون تیروزین و ایجاد و 3و 4 – هیدروکسی فنیل آلانین (دوپا) و اکسیداسیون دوپا به دوپا کوینون . در موش اکسیداسیون( 5, 6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA به indole-5, 6-quinone-2-carboxylic acid مشاهده شده ولی این واکنش در TRP1 انسان شناخته شده نیست . DCT دوپاکروم را به DHICA ایزومریزه می کند.
در این مطالعه ، ما اثر روغن آرگان بر ملانوژنز برای تایید این باور سنتی که روغن آرگان میتواند موجب حفظ تعادل چهره شود را ارزیابی کردیم . روغن آرگان با محیط رشد سلول B16 ترکیب شد و به مدت 48 و 72 ساعت انکوبه شده و محتوای ملانین سلولها را کاهش داد(شکل 1) . دپیگمنتاسیون مشاهده شده به دلیل کاهش در سطح بیان انزیم های ملانوژنز با کاهش چشمگیرتر TYR و DCT نسبت به TRP1 دانسته شد. (شکل 2). تیروزیناز انزیم محدود کننده ی ملانوژنز است که دو مرحله ی ابتدایی سنتز ملانین را انجام میدهد. کاهش در محتوای ملانین سلئلها بعد از 48 ساعت مشاهده شد اما بیشترین کاهش مربوط به 72 ساعت پس از تیمار بود.اگرچه رقت 1/10000 کاملا باعث بروز دپیگمنتاسیون می¬شود ولی بازدارندگی چشمگیر سنتز ملانین و بدون اثرات سیتوتوکسیک در رقت 1/1000 مشاهده می¬شود که در این نقطه با اربوتین 100µM یکسان است. اثرات روغن آرگان در رقت1/100 نیز چشمگیر بود ولی بعث کاهش جزئی در شمار سلولی نیز میشود. ما سپس بیان تیروزیناز را با وسترن بلات بررسی کردیم . نتایج نشان داد که بیان آنزیم تیروزیناز با تیمار سلول با روغن آرگان کاهش یافت (شکل 2). همچنین هیچ کاهش فوری در غلظت، مثلا 4 ساعت پس از تیمار در طول انکوباسیون مشاهده نشد. روغن آرگان اثر بازدارندگی بر TRP1 نشان نداد و این جای تعجب نیست زیرا TRP1 و DCT تنها 40 درصد با TYR همولوژی اسید امینه ای دارند.توالی ساختاری و پروموتری TRP1 با TYR بسیار متفاوت است. با این وجود دلیل اثر مشاهده شده ی روغن آرگان بر بیان TRP1 هنوز مبهم است.
برای پی بردن به مکانیسم کاهش سطوح پروتیین انزیم های ملانوژنیک ، بیان در سطح رونویسی نیز تعیین شد و نتایج نشان داد که سطوح mRNA انها نیز با تیمار روغن آرگان کاهش می¬یابد (شکل 3). کنترل بیان TYR (محدود کننده ی سرعت ملانوژنز ) به تنظیم در سطح رونویسی بستگی دارد. برخی از مهارکننده های ملانوژنز مانند TPA کاهش در سطحm RNA ژن tyr را نشان داده اند و در مورد روغن آرگان پدیده ی یکسانی مش اهده شده است. همانطور در شکل 4 نشان داده شده است ، سطح بیان mRNA ژن tyr به دنبال تیمار با روغن آرگان کاهش یافته است.
بیان ژن¬های انزیم های ملانوژنیک با MITF تنظیم میشود و نتایج ما نشان دهنده ی افزایش فعالیت MITF است. فسفریلاسیون MITF با تجزیه¬ی بعدی آن مرتبط است. MITF در تمایز ، تکثیر و حفظ ملانوسیت نقش بسیار مهمی ایفا میکند. برای تعیین علت افزایش فعالیت MITF ، یک افزایش وابسته به زمان در فسفریلاسیون ERK انجام شد و نتایج نشان داد که تیمار با روغن آرگان سبب افزایش فعالیت ERK1/2 می-شود(شکل 3) در مقایسه با هیریسین A (افزایش فسفریلاسیون بعد از یک ساعت پس از تیمار) روغن آرگان باعث افزایش فسفریلاسیون ERK بعد از 24 ساعت پس از تیمار میشود. ثابت شده است که فعال شدن پیوسته¬ی MAPK ERK منجر به تجزیه¬ی MITF میشود. ERK تعدادی از اهداف سیتوپلاسمی فسفریله میکند و یا به هسته مهاجرت میکند و در آنجا تعدادی از فاکتورهای رونویسی مانند MIFT را فسفریله و فعال میکند. MAP kinase, و ERK2 ، MIFT را فسفریله میکنند و بنابراین فاکتور رونویسی را برای پرای تجزیه در پوتئوزوم هدف گذاری میکنند. بنابراین علاوه بر تنطیم مجموعه¬ی رونویسی ، ملانوژنز همچنین تحت یک تنظیم پسا ترجمه¬ای نیز قرار دارد که عملکرد MITF و TYR را کنترل می کند.
همانطور که به صورت خلاصه در جدول 1، 2 و 3 آورده شده است، روغن آرگان غنی از توکوفرول و اسیدهای چرب غیر اشباع مانند اولئیک اسید است. روغن آرگان در ارزیابی سفید کنندگی بتاکاروتن /لینولئیک اسید یک فعالیت آنتی اکسیدانتی جالب توجهی از خود نشان داد. اثر سفیدکنندگی توکوفرول –الفا که به عنوان ویتامین E شناخته میشود گزارش شده است. مصرف خوراکی ویتامین E میتواند بویزه با ترکیب شدن با ویتامین C باعث بهبود هیپرپیگمنتاسیون صورت شود. قرار گیری در معرض UV باعث پراکسیداسیون لیپید در صورت میشود که باعث آسیب به سلولهای اپیدرمال شده و منجر به هیپرچیگمنتاسیون پس از التهاب می¬گردد.
خواص انتی اکسیدانتی و احیاءکنندگی روغن آرگان به سلولها کمک میکند تا در غیاب ملانین در مقابل استر اکسیداتیو مقاومت کنند. ملانین یک خاصیت تجزیه کنندگی رادیکال های آزاد در سلولهای رنگدانه ای را دارد. در شرایطی که ملانین کاهش می¬یابد ، مانند سلولهای تیمار شده با روغن ارگان با سلولهای بدون ملانوسیت مانند OCA2 ، مهار کننده های استرس اکسیداتیو میتوانند از اسیب های اکسیداتیو جلوگیری کنند. Fujiwara و همکارانش گزارش کردند که ، ویتامین E تجویز شده با ویتامینC به عنوان تجزیه کننده ی رادیکال آزاد عمل کرده و سایتوکاین های ملانوژنیک را مهار میکند و این به دلیل اثر سینرژیک ویتامین A و C بر روی سلولهای ملانوما است.
این مکانیسم همچنین میتواند چگونگی کارکرد اجزاء مختلف روغن آرگان در مهار سنتز ملانین در سلول های B16 را توجیه کند. روغن آرگان دارای خواص انتی اکسیدانتی و ضد پیری است و بنابراین میتواند استرس اکسیداتیو را در سلولها کاهش دهد اما ممکن است این اثر با اثر آن بر ملانوژنز مرتبط نباشد.
برای مثال Alpha-MSH ، به عنوان یک تحریک کننده ی ملانوژنز شناخته شده، دارای اثر مهارکنندگی استرس اکسیداتیو در ملانوسیتهای انسانی و نیز سلولهایی که توانایی سنتز ملانین را از دست داده اند است (سلولهای با جهش OCA2) این نشان میدهد که اثر انتی اکسیدانتی آن مستقیما با اثرات تنظیمی آن در ملانوژنز ربطی ندارد. اثر انتی اکسیدانت روغن آرگان میتواند سلولها را اسیب های اکسیداتوی ناشی از تابش UV در غیاب ملانین و اثرات دپیگمنتاسیون ان روی پوست محافظت کند. به این ترتیب یک پایه ی علمی برای اثرات روغن آرگان در کاهش سرعت ظهور چین و چروک و مبارزه با خشکی پوست فراهم میکند.
اگرچه توکوفرول ها اصلی ترین اجزاء روغن آرگان در ملانوژنز هستند اما نقش سایر اجزاء نیز میتواند مهم باشد. روغن آرگان همچنین حاوی اسیدهای چرب آزاد است که اثرات فعال کنندگی تیروزیناز در آنها گزارش شده است. لینولئیک اسید فعالیت تیروزیناز را کاهش و پالمتیک اسید آن را افزایش می¬دهد. نمونه ی روغن آرگان استفاده شده در این مطالعه دارای 28.47% لینولئیک اسید، 12.2% پالمتیک اسید است و همچنین میتوان گفت که محتوی لینولئیک اسید بالا میتواند باعث کاهش فعالیت تیروزیناز شود نتایج این مطالعه نشان داد که روغن آرگان فعالیت تیروزیناز قارچ خوراکی را متاثر نمیکند (نتایج نیاورده شده است) . قطعا و بر اساس گزارش Ando و همکارانش فعالیت تیروزیناز باسطح mRNA ژن TYR مرتبط نیست . بنابراین اثر دپیگمنتاسیون پوست به دلیل مهار بیان انزیم های ملانوژنیک (TYR و DCT) را میتوان به اجزاء اصلی (توکوفرول ها ) و یا اثر سینرژیک تمام اجزاء روغن آرگال نسبت داد.
5. نتیجه گیری
اکنون یک رغبت دوباره نسبت به گیاهان به عنوان ترکیبات دارویی در دنیای غرب وجود دارد و این رغبت به دلیل کشف مولکلوهای زیستی جدید و پذیرش عمومی گیاهان برای خود درمانی در افکار عمومی است. طب سنتی افریقای شمالی ، در حفظ سلامت تمام بخش های دنیا و ارائه درمان های جدید سهم مهمی داشته است. اگرچه برخی از افراد ممکن است استخراج نرکیبات و استفاده از آنها به عنوان ترکیبات شییمیایی واخد را گزینه ی بهتر بدانند اما اکنون دیدگاهی وجود دارد مبنی بر اینکه استفاده از عصاره به جای استخراج یک ترکیب واحد دارای مزیت های بیشتر ی است. گزارش های منتشر شده در باره¬ی فواید دارویی مصرف خوراکی روغن آرگان توسط 52 خلاصه شده است، اما اثرات آن بر سلولهای رنگدانه ای هنوز گزارش نشده است. در اینجا ما روغن آرگان را به عنوان یک مهارکننده¬ی موثر بیوسنتز ملانین معرفی میکنیم که اثرات ان میتواند به اجزاء واحد آن یا عملکرد سینرژیک تمام اجزاء نسبت داده شود. اگرچه اثر اجزاء روغن آرگال (توکوفورل ها ، اسیدهای چرب و غیره ) بر بیوسنتز ملانین گزارش شده است اما این گزارش درباه¬ی اولین گزارش در خصوص اثر مهارکنندگی روغن آرگان بر ملانوژنز در سلولهای B16 است که پایه های علمی لازم برای یک دانش سنتی مبنی بر اثرات مفید روغن آرگال بر پوست را فراهم میکند.
تقدیر و تشکر
این تحقیق با حمایت جامعه¬ی ارتقاء علوم ژاپن (JSPS) تحت برنامه ی همکاری علمی آسیا- آفریقا موسوم به “انجام تحقیقات مشترک توسط افراد و دانشمندان بر روی معتبر سازی گیاهان مفید برای توسعه ی محلی در افریقای شمالی ” انجام شد. References
1. Guillaume D, Charrouf Z. Argan oil and other argan products: use in dermocosmetology. The European Journal of Lipid Science and Technology. 2011;113(4):403–408.
2. Nouaim R, Mangin G, Breuil MC, Chaussod R. The argan tree (Argania spinosa) in Morocco: propagation by seeds, cuttings and in-vitro techniques. Agroforestry Systems. 2002;54(1):71–81.
3. Charrouf Z, Guillaume D. Ethnoeconomical, ethnomedical, and phytochemical study of Argania spinosa (L.) Skeels. Journal of Ethnopharmacology. 1999;67(1):7–14. [PubMed]
4. Charrouf Z, Guillaume D. Argan oil: occurrence, composition and impact on human health. The European Journal of Lipid Science and Technology. 2008;110(7):632–636.
5. Drissi A, Girona J, Cherki M, et al. Evidence of hypolipemiant and antioxidant properties of argan oil derived from the argan tree (Argania spinosa) Clinical Nutrition. 2004;23(5):1159–1166. [PubMed]
6. Cherki M, Berrougui H, Drissi A, Adlouni A, Khalil A. Argan oil: which benefits on cardiovascular diseases? Pharmacological Research. 2006;54(1):1–5. [PubMed]
7. Bennani H, Drissi A, Giton F, Kheuang L, Fiet J, Adlouni A. Antiproliferative effect of polyphenols and sterols of virgin argan oil on human prostate cancer cell lines. Cancer Detection and Prevention. 2007;31(1):64–69. [PubMed]
8. Khallouki F, Younos C, Soulimani R, et al. Consumption of argan oil (Morocco) with its unique profile of fatty acids, tocopherols, squalene, sterols and phenolic compounds should confer valuable cancer chemopreventive effects. The European Journal of Cancer Prevention. 2003;12(1):67–75. [PubMed]
9. Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation. Pigment Cell Research. 2003;16(2):101–110. [PubMed]
10. Tsukamoto K, Jackson IJ, Urabe K, Montague PM, Hearing VJ. A second tyrosinase-related protein, TRP-2, is a melanogenic enzyme termed DOPAchrome tautomerase. EMBO Journal. 1992;11(2):519–526. [PMC free article] [PubMed]
11. Kameyama K, Takemura T, Hamada Y, et al. Pigment production in murine melanoma cells is regulated by tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP1), DOPAchrome tautomerase (TRP2), and a melanogenic inhibitor. Journal of Investigative Dermatology. 1993;100(2):126–131. [PubMed]
12. Brenner M, Hearing VJ. Modifying skin pigmentation—approaches through intrinsic biochemistry and exogenous agents. Drug Discovery Today. 2008;5(2):e189–e199. [PMC free article] [PubMed]
13. Ortonne J-P, Pandya AG, Lui H, Hexsel D. Treatment of solar lentigines. Journal of the American Academy of Dermatology. 2006;54(5):S262–S271. [PubMed]
14. Kanthraj GR. Skin-lightening agents: new chemical and plant extracts -ongoing search for the holy grail! The Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 2010;76(1):3–6. [PubMed]
15. Parvez S, Kang M, Chung H-S, et al. Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents. Phytotherapy Research. 2006;20(11):921–934. [PubMed]
16. Kawano M, Matsuyama K, Miyamae Y, et al. Antimelanogenesis effect of Tunisian herb Thymelaea hirsuta extract on B16 murine melanoma cells. Experimental Dermatology. 2007;16(12):977–984. [PubMed]
17. Villareal MO, Han J, Yamada P, Shigemori H, Isoda H. Hirseins inhibit melanogenesis by regulating the gene expressions of Mitf and melanogenesis enzymes. Experimental Dermatology. 2010;19(5):450–457. [PubMed]
18. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmenting agents: an updated review on biological, chemical and clinical aspects. Pigment Cell Research. 2006;19(6):550–571. [PubMed]
19. Arndt KA, Fitzpatrick TB. Topical use of hydroquinone as a depigmenting agent. Journal of the American Medical Association. 1965;194(9):965–967. [PubMed]
20. Maeda K, Naganuma M. Topical trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid prevents ultraviolet radiation-induced pigmentation. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 1998;47(2-3):136–141. [PubMed]
21. Nakagawa M, Kawai K, Kawai K. Contact allergy to kojic acid in skin care products. Contact Dermatitis. 1995;32(1):9–13. [PubMed]
22. Raynaud E, Cellier C, Perret J-L. Depigmentation for cosmetic purposes: prevalence and side-effects in a female population in Senegal. Annales de Dermatologie et de Venereologie. 2001;128(6-7):720–724. [PubMed]
23. Kim Y-J, Uyama H. Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future. Cellular and Molecular Life Sciences. 2005;62(15):1707–1723. [PubMed]
24. Hayakawa R. Clinical research group on a combination preparation of vitamins E and C. Effects of combination preparation of vitamin E and C in comparison with single preparation to the patients of facial hyperpigmentation: a double-blind controlled clinical trial. Nishinihon Journal of Dermatology. 1980;42:1024–1034. (Jpn).
25. Funasaka Y, Komoto M, Ichihashi M. Depigmenting effect of α-tocopheryl ferulate on normal human melanocytes. Pigment Cell Research. 2000;13(8):170–174. [PubMed]
26. Stahl W, Sies H. Lycopene: a biologically important carotenoid for humans? Archives of Biochemistry and Biophysics. 1996;336(1):1–9. [PubMed]
27. Miraliakbari H, Shahidi F. Antioxidant activity of minor components of tree nut oils. Food Chemistry. 2008;111(2):421–427. [PubMed]
28. Bounatirou S, Smiti S, Miguel MG, et al. Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of the essential oils isolated from Tunisian Thymus capitatus Hoff. et Link. Food Chemistry. 2007;105(1):146–155.
29. Berrougui H, Ettaib A, Gonzalez MDH, de Sotomayor MA, Bennani-Kabchi N, Hmamouchi M. Hypolipidemic and hypocholesterolemic effect of argan oil (Argania spinosa L.) in Meriones shawi rats. Journal of Ethnopharmacology. 2003;89(1):15–18. [PubMed]
30. Lybbert TJ, Barrett CB, Narjisse H. Market-based conservation and local benefits: the case of argan oil in Morocco. Ecological Economics. 2002;41(1):125–144.
31. Schallreuter KU, Wood JM, Pittelkow MR, et al. Regulation of melanin biosynthesis in the human epidermis by tetrahydrobiopterin. Science. 1994;263(5152):1444–1446. [PubMed]
32. Iwata M, Corn T, Iwata S, Everett MA, Fuller BB. The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins. Journal of Investigative Dermatology. 1990;95(1):9–15. [PubMed]
33. Iozumi K, Hoganson GE, Pennella R, Everett MA, Fuller BB. Role of tyrosinase as the determinant of pigmentation in cultured human melanocytes. Journal of Investigative Dermatology. 1993;100(6):806–811. [PubMed]
34. Maeda K, Fukuda M. In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. Journal of the Society of Cosmetic Chemists. 1991;42:361–368.
35. Maeda K, Fukuda M. Arbutin: mechanism of its depigmenting action in human melanocyte culture. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1996;276(2):765–769. [PubMed]
36. Budd PS, Jackson IJ. Structure of the mouse tyrosinase-related protein-2/dopachrome tautomerase (Tyrp2/Dct) gene and sequence of two novel slaty alleles. Genomics. 1995;29(1):35–43. [PubMed]
37. Kobayashi T, Urabe K, Winder A, et al. Tyrosinase related protein 1 (TRP1) functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis. EMBO Journal. 1994;13(24):5818–5825. [PMC free article] [PubMed]
38. Jackson IJ, Chambers DM, Budd PS, Johnson R. The tyrosinase-related protein-1 gene has a structure and promoter sequence very different from tyrosinase. Nucleic Acids Research. 1991;19(14):3799–3804. [PMC free article] [PubMed]
39. Ferguson CA, Kidson SH. The regulation of tyrosinase gene transcription. Pigment Cell Research. 1997;10(3):127–138. [PubMed]
40. Ando H, Itoh A, Mishima Y, Ichihashi M. Correlation between the number of melanosomes, tyrosinase mRNA levels, and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in response to various melanogenesis regulatory agents. Journal of Cellular Physiology. 1995;163(3):608–614. [PubMed]
41. Bellei B, Maresca V, Flori E, Pitisci A, Larue L, Picardo M. p38 regulates pigmentation via proteasomal degradation of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 2010;285(10):7288–7299. [PMC free article] [PubMed]
42. Widlund HR, Fisher DE. Microphthalamia-associated transcription factor: a critical regulator of pigment cell development and survival. Oncogene. 2003;22(20):3035–3041. [PubMed]
43. Kim D-S, Hwang E-S, Lee J-E, Kim S-Y, Kwon S-B, Park K-C. Sphingosine-1-phosphate decreases melanin synthesis via sustained ERK activation and subsequent MITF degradation. Journal of Cell Science. 2003;116(9):1699–1706. [PubMed]
44. Buscà R, Ballotti R. Cyclic AMP a key messenger in the regulation of skin pigmentation. Pigment Cell Research. 2000;13(2):60–69. [PubMed]
45. Kamei Y, Otsuka Y, Abe K. Comparison of the inhibitory effects of vitamin e analogues on melanogenesis in mouse B16 melanoma cells. Cytotechnology. 2009;59(3):183–190. [PMC free article] [PubMed]
46. Shimizu K, Kondo R, Sakai K, Takeda N, Nagahata T, Oniki T. Novel vitamin E derivative with 4-substituted resorcinol moiety has both antioxidant and tyrosinase inhibitory properties. Lipids. 2001;36(12):1321–1326. [PubMed]
47. Houghton PJ. The role of plants in traditional medicine and current therapy. Journal of Alternative and Complementary Medicine. 1995;1(2):131–143. [PubMed]
48. Fujiwara Y, Sahashi Y, Aritro M, et al. Effect of simultaneous administration of vitamin C, L-cysteine and vitamin e on the melanogenesis. BioFactors. 2004;21(1–4):415–418. [PubMed]
49. Kadekaro AL, Chen J, Yang J, et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone suppresses oxidative stress through a p53-mediated signaling pathway in human melanocytes. Molecular Cancer Research. 2012;10(6):778–786. [PubMed]
50. Phillipson JD. A matter of some sensitivity. Phytochemistry. 1995;38(6):1319–1343. [PubMed]
51. Phillipson JD. Phytochemistry and medicinal plants. Phytochemistry. 2001;56(3):237–243. [PubMed]
52. Monfalouti HE, Guillaume D, Denhez C, Charrouf Z. Therapeutic potential of argan oil: a review. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2010;62(12):1669–1675. [PubMed

تحقیقی- روغن آرگان خالص , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

copy right